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當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章細胞培養(yǎng)中常見的問題解答

細胞培養(yǎng)中常見的問題解答

更新時間:2022-03-30點擊次數(shù):2090

標(biāo)簽:細胞 細胞培養(yǎng) 液氮 培養(yǎng)基 

細胞培養(yǎng)是生命科學(xué)實驗中的基礎(chǔ)實驗,在細胞生長過程中,很多因素都會造成細胞生長不良。下面簡單歸納一下細胞生長不良的原因及對應(yīng)的解決方案。 

常見問題一:為什么細胞解凍后缺少活力,活細胞占比較低?

這種現(xiàn)象可能主要由以下幾種原因所導(dǎo)致:

1.培養(yǎng)物凍存液等質(zhì)量欠缺。

解決方案:

a.確保用來制備儲存物(凍存液)的起始培養(yǎng)物需要保證其健康、無微生物污染、處于生長對數(shù)期后期狀態(tài)。

b.收獲細胞時需要小心翼翼,避免細胞損傷。 

2.儲存物凍存方法不當(dāng)

解決方案:

a.在液氮冷凍細胞時,確保細胞、培養(yǎng)基和其他試劑的濃度,以及凍存實驗步驟依照供應(yīng)商的建議。一般來說,凍存應(yīng)該緩慢,大約1-3° C/min以減少冰晶形成。

b.使用電子可編程或機械冷凍裝置以確保一致的、適當(dāng)速率的冷凍。

c.選擇最合適的細胞冷凍保護劑。如果使用甘油,不要將其存儲在光照下,因為曝光會使甘油轉(zhuǎn)化為有對細胞毒性的物質(zhì)。

3.儲存物保存不當(dāng) 

解決方案:

a.儲存物應(yīng)時刻保持在-130℃,理想情況是置于液氮中,以確保較大的細胞活性。

b.如果將細胞直接浸入液氮中,容易造成液氮泄露到凍存管內(nèi),解凍時會有凍存管爆炸的風(fēng)險。所以一般儲存在液氮上方的氣相環(huán)境中。 

4.細胞解凍方法不當(dāng) 

解決方案:

a.一般來說,細胞應(yīng)該快速解凍、使用預(yù)熱的培養(yǎng)基、盡快移除含有冷凍保護劑的培養(yǎng)基防止細胞活力下降。

b.確保小心操作細胞。不要渦旋或高速離心,因為低溫保存后的特別容易受到損傷。

細胞培養(yǎng)

常見問題二:細胞進行解凍或傳代后細胞附著力偏低?

這種情況主要是因為濕度過低致使培養(yǎng)容器上集聚靜電所致。

可以通過適當(dāng)增加房間濕度,使用防靜電裝置或者用消毒過的濕毛巾擦拭培養(yǎng)容器外側(cè),來減低靜電產(chǎn)生。另外試劑混合不均勻,培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)速等因素也可導(dǎo)致此現(xiàn)象發(fā)生。所以在進行細胞培養(yǎng)時,要確保細胞和所有試劑的溶液混合充分。在使用振蕩培養(yǎng)箱進行細胞培養(yǎng)時,注意設(shè)置適宜的轉(zhuǎn)速。

常見問題三:為什么細胞生長速度緩慢?

細胞生長過慢有很多原因,其主要原因如下:

1.細胞的傳代次數(shù)太多,所以獲得一個新的、亞培養(yǎng)次數(shù)較少的細胞儲存液很有必要。

2.未選擇合適的細胞收獲時機。

在使用新的細胞儲存液的同時,也要把我好適宜的細胞收獲時機,一般在對數(shù)生長期的后期是細胞收獲時間當(dāng)細胞達到100%融合后,由于生長過于擁擠,會逐漸進入緩慢生長階段,此時,細胞的活躍度也會隨之下降。

培養(yǎng)基、血清、緩沖液等質(zhì)量差,或者配方不合理。培養(yǎng)基、血清等培養(yǎng)物質(zhì)是細胞生長的主要營養(yǎng)來源,所以其質(zhì)量直接會影響到細胞的生長狀態(tài)。所以高質(zhì)量的培養(yǎng)基及合理的試劑配方維持細胞的良好生長具有決定的作用。

3.CO2濃度與緩沖系統(tǒng)需求不匹配,導(dǎo)致pH控制不足。

一般來說,細胞培養(yǎng)液中緩沖液中NaHCO3的濃度與CO2濃度成正比例關(guān)系。緩沖液中NaHCO3 的濃度高,所需求的CO2濃度也較高;這樣才能達到PH平衡。

4.微生物污染,尤其是支原體

及時檢查污染,防止微生物污染,做好支原體、器皿、環(huán)境消毒、支原體清除等工作。

5.培養(yǎng)物光敏降解產(chǎn)生細胞毒性物質(zhì)。

如果培養(yǎng)基長時間暴露于熒光將會導(dǎo)致光敏感培養(yǎng)基組分轉(zhuǎn)化成細胞毒性自由基和H2O2,從而影響到細胞生長甚至細胞凋亡。所以平時要在暗處保存細胞核培養(yǎng)基,避免熒光暴露。

6.不精確的細胞計數(shù)方法將導(dǎo)致細胞生長不良

a.確保計數(shù)樣本充分混合,避免局部細胞密度差異影響精確計數(shù)

b.再次檢查使用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)的所有運算  

細胞培養(yǎng)

常見問題四:為什么細胞生長會不均勻?

1.細胞或培養(yǎng)基混合不充分:在培養(yǎng)基中接入細胞后應(yīng)當(dāng)輕搖混勻,在進入振蕩培養(yǎng)箱后,保證持續(xù)穩(wěn)定的振幅頻率,避免局部濃度差異。

2.在細胞培養(yǎng)過程中有時候會出現(xiàn)同一時期相同器皿之間細胞生長不平衡

這種情況可能是由于培養(yǎng)箱內(nèi)部的溫度不均一所導(dǎo)致。注意做好以下兩點:

a.避免將培養(yǎng)器皿疊放,因為底部的培養(yǎng)器皿最靠近金屬架可能加熱最快。

b.如果放在培養(yǎng)箱前部的培養(yǎng)器皿比后面的生長慢,要注意保持培養(yǎng)箱的門盡可能關(guān)嚴(yán),并將前面的培養(yǎng)器皿移到后面。

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