隨著藥物靶點(diǎn)復(fù)雜性的增加，哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中的基因重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)變得越來越普遍。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式 適當(dāng)?shù)?/span>進(jìn)行蛋白質(zhì)的折疊、組裝和翻譯后修飾對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)也具有重要的意義 。 

  源自 CHO 和 HEK 293 細(xì)胞的懸浮細(xì)胞系通常用于哺乳動物蛋白質(zhì)生產(chǎn)。這些細(xì)胞系具有許多理想的特性，包括高表達(dá)水平、可擴(kuò)展性（密度和體積）等等。

部分基因藥物會使用穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染劑，以實(shí)現(xiàn)批次間的一致性和大規(guī)模的低成本。在過去十年中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面也有著許多進(jìn)展，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法在改進(jìn)的細(xì)胞系、表達(dá)載體、培養(yǎng)基和遞送方法、哺乳動物蛋白表達(dá)等方面也被廣泛使用。

在許多藥物發(fā)現(xiàn)應(yīng)用中，使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法快速篩選蛋白質(zhì)構(gòu)建體是有益的，因?yàn)樗?/span>可以同時(shí)評估各種靶分子或蛋白質(zhì)亞型。在多數(shù)情況下，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是并行進(jìn)行的，而更多資源密集型的穩(wěn)定細(xì)胞系也正在開發(fā)中。

轉(zhuǎn)染技術(shù)的使用穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染試劑盒 ，可以提高懸浮 CHO 和 293 衍生細(xì)胞中的抗體蛋白滴度。比如：使用 Mirus Bio 的技術(shù)，通過添加質(zhì)粒 DNA、Trans IT-PRO 轉(zhuǎn)染試劑和 PRO Boost 試劑在無血清培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。

 將復(fù)合物孵育 10-30 分鐘后，可以將它們直接添加到正常生長培養(yǎng)基中的細(xì)胞中。使用快速轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，無需在轉(zhuǎn)染后更換培養(yǎng)基，適用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。對于分泌型抗體構(gòu)建體，通常在分批發(fā)酵轉(zhuǎn)染后 5-7 天獲得Max滴度。

在優(yōu)化瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方案期間應(yīng)當(dāng)考慮以下幾個參數(shù)，主要包括：轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度、DNA 濃度、試劑與 DNA 的比率和細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.細(xì)胞密度

在任何組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之前，細(xì)胞健康是一個重要的考慮因素。理想情況下，細(xì)胞應(yīng)具有一致的倍增時(shí)間和高活力。細(xì)菌、酵母菌、病毒或支原體的污染不僅會損害細(xì)胞健康，還會降低轉(zhuǎn)染效率。

對于可以生長到較高密度的懸浮細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染時(shí)優(yōu)化細(xì)胞密度尤其重要。當(dāng)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過程中積極分裂時(shí)效率為Max值，這有助于質(zhì)粒DNA 進(jìn)入細(xì)胞核。圖 1顯示了 CHO 懸浮細(xì)胞密度的滴定，范圍為 0.25 x 10 6 –2.0 x 10 6 個細(xì)胞/mL。在轉(zhuǎn)染時(shí)，在 0.5 x 10 6 –1.0 x 10 6 個細(xì)胞/mL之間的細(xì)胞密度下檢測到最大數(shù)量的 GFP 表達(dá)細(xì)胞（約 60%） 。

圖 1. 轉(zhuǎn)染時(shí)的最佳細(xì)胞密度為 0.5 x 10 6 –1.0 x 10 6 個細(xì)胞/mL。CHO-S 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)使用Trans IT-PRO 轉(zhuǎn)染試劑盒以一定范圍的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)染。使用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP) 報(bào)告質(zhì)粒，使用 1:1:1 比例的反式 IT-PRO:Boost 試劑:DNA 形成復(fù)合物。使用流式細(xì)胞術(shù)在轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)確定 GFP 轉(zhuǎn)染效率。使用在 FreeStyle CHO 表達(dá)培養(yǎng)基（2 mL/孔）中培養(yǎng)的 FreeStyle™ CHO-S 細(xì)胞在 24 孔深孔搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。誤差棒代表一式三份孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.DNA濃度

在某些細(xì)胞類型中，增加質(zhì)粒 DNA 濃度也會提升轉(zhuǎn)染效率，提高基因表達(dá)。然而， DNA 的濃度如果過高，會使成本增加或者產(chǎn)生毒性。圖 2使用三種不同劑量的Trans IT-PRO 和 PRO Boost 試劑檢查了每毫升培養(yǎng)物 0.25–3.0 µg 的一系列質(zhì)粒 DNA 濃度。通常，每毫升培養(yǎng)物中 1.0–1.5 µg DNA ,是細(xì)胞表達(dá)的Max濃度。

圖 2. 使用Trans IT-PRO 轉(zhuǎn)染試劑盒滴定 DNA 濃度和試劑與 DNA 的比率。在不同的質(zhì)粒濃度 (0.25–3.0 µg/mL) 和使用三種不同比例的Trans IT-PRO:PRO Boost Reagent (0.5:0.5、1:1 和 2:2)/µg DNA 比較熒光素酶蛋白表達(dá)。使用在 BD Select CD1000 培養(yǎng)基（2 mL/孔）中培養(yǎng)的 FreeStyle CHO-S 細(xì)胞在 24 孔深孔搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞以 0.5 x 10 6 個細(xì)胞/mL的密度鋪板，轉(zhuǎn)染后 48 小時(shí)收獲，并使用常規(guī)熒光素酶測定法進(jìn)行測定。誤差棒代表一式三份孔的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.試劑濃度

試劑與 DNA 的比率也是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染速度的主要參數(shù)。如果試劑量不足或過量都會阻礙 DNA 遞送。這是由于陽離子轉(zhuǎn)染試劑和帶負(fù)電的質(zhì)粒 DNA 之間的靜電相互作用促進(jìn)了轉(zhuǎn)染復(fù)合物的質(zhì)膜結(jié)合和內(nèi)化。然而，過多的正電荷通常與細(xì)胞毒性有關(guān)，因此需要滴定轉(zhuǎn)染試劑與 DNA 的比率以確定峰值蛋白質(zhì)的表達(dá)。

圖 2比較了三種不同水平的Trans IT-PRO 和 PRO Boost Reagent（每 µg DNA 0.5 µL–2.0 µL）；使用濃度為每 1.0 µg DNA 各 1.0 µL 的Trans IT-PRO 和 PRO Boost 試劑可獲得Max的熒光素酶表達(dá)。

3.培養(yǎng)基試劑配方

轉(zhuǎn)染效率受培養(yǎng)生長培養(yǎng)基的影響，并且有許多市售的無血清生長培養(yǎng)基用于生物功能型蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。由于這些培養(yǎng)基配方是專有的，因此可能需要測試幾種培養(yǎng)基配方以找到與所需轉(zhuǎn)染方法互補(bǔ)的一種。

圖 3顯示了懸浮 CHO 細(xì)胞，它們已適應(yīng)五種不同的培養(yǎng)基配方。使用多種轉(zhuǎn)染方法，包括： Trans IT-PRO 轉(zhuǎn)染試劑盒、試劑 P 和試劑 F（圖 3） ，用編碼人 IgG1 抗體構(gòu)建體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染適應(yīng)相應(yīng)培養(yǎng)基的細(xì)胞。

在給定的轉(zhuǎn)染方法中，分泌的抗體滴度變化超過 10 倍，具體取決于培養(yǎng)基類型。此外，并非所有轉(zhuǎn)染技術(shù)都表現(xiàn)出廣譜培養(yǎng)基兼容性。

懸浮 CHO 衍生細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率直接關(guān)系到靶向藥物的研發(fā)和生產(chǎn)。值得注意的是，蛋白質(zhì)產(chǎn)量嚴(yán)重依賴于重組蛋白質(zhì)的內(nèi)在特性。相同亞型的兩種抗體構(gòu)建體可以產(chǎn)生截然不同的蛋白質(zhì)滴度。比較兩種或多種轉(zhuǎn)染方法時(shí)，請?jiān)谕惶焓褂孟嗤馁|(zhì)粒 DNA 構(gòu)建體和相同批次的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。這允許小化細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)變量。

Trans IT-PRO 轉(zhuǎn)染試劑盒等新轉(zhuǎn)染方法使研究人員能夠以直接一致的方式獲得更高的蛋白質(zhì)滴度。關(guān)鍵轉(zhuǎn)染參數(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化使研究人員能夠獲得高轉(zhuǎn)染效率和足夠的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，以加速藥物發(fā)現(xiàn)。

圖 3. 蛋白質(zhì)產(chǎn)量取決于培養(yǎng)基配方和轉(zhuǎn)染方法。FreeStyle CHO-S 細(xì)胞適應(yīng)五種代表性生長培養(yǎng)基。使用Trans IT-PRO 和 PRO Boost Reagent (1:1:1)、Reagent P (4:1) 或 Reagent F (1:1) 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在 24 孔深孔搖床塊中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每毫升培養(yǎng)物中使用 1 µg DNA，轉(zhuǎn)染時(shí)使用 0.5 x 10 6 個細(xì)胞/mL。從第 5 天澄清的上清液對人 IgG1 進(jìn)行定量，并通過標(biāo)準(zhǔn)夾心 ELISA 進(jìn)行分析。誤差棒代表一式三份孔的

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