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當前位置:首頁技術文章Vero細胞無血清懸浮培養(yǎng)技術驗證

Vero細胞無血清懸浮培養(yǎng)技術驗證

更新時間:2023-03-01點擊次數(shù):1069

大多數(shù)用于抗體生產(chǎn)的細胞主要基于動物細胞上的開發(fā),如 MRC-5 人二倍體細胞、 Vero 猿猴腎上皮細胞、Madin-Darby 犬腎 (MDCK) 細胞和雞胚成纖維細胞 。尤其是來自非洲綠猴腎臟的 Vero 細胞已被廣泛用于vaccine生產(chǎn),因為它們被WHO機構證明沒有致癌潛力。許多vaccine,例如針對基孔肯雅熱、登革熱、日本腦炎、病毒性胃腸炎、脊髓灰質炎、狂犬病、羅斯河熱、嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥、天花、西尼羅河腦炎和流感的 vaccine都是使用 Vero 細胞培養(yǎng)系統(tǒng)開發(fā)的。
用于virus  vaccine生產(chǎn)的細胞依賴于貼壁,因此涉及這些細胞的過程不能輕易擴大規(guī)模,因為需要貼壁空間和胰蛋白酶消化。這導致了具有懸浮生長能力的永生和穩(wěn)定細胞系的發(fā)展.近期研究中,研究人員成功地在微載體上培養(yǎng)了 Vero 細胞,用于制備這些細胞的懸浮培養(yǎng)物。實驗表明,在沒有微載體的情況下培養(yǎng)的懸浮適應性 Vero 細胞比貼壁 Vero 細胞產(chǎn)生更高量的 virus。
Vero 細胞培養(yǎng)使用動物來源的成分較多,如血清、胰蛋白酶、乳清蛋白等。由于成本高和批次間差異,盡量使用血清。此外,牛血清的病毒、細菌和真菌、支原體污染也是細胞培養(yǎng)中的主要污染來源。因此,無血清細胞培養(yǎng)體系的優(yōu)化對于疫苗株的生產(chǎn)是必要的。  之前的研究中,在無血清 EX-Cell MDCK 中培養(yǎng)的 MDCK 細胞比在含血清的 Glasgow 低必需培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞產(chǎn)生更多的 virus。此外,還探索了在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) Vero 細胞來生產(chǎn)許多virus  vaccine。
在這項研究中,我們試圖促進 Vero 細胞在振蕩懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中的適應性,并確定哪種培養(yǎng)基適合在無血清的情況下培養(yǎng) Vero 細胞。與傳統(tǒng)的 Vero 細胞貼壁培養(yǎng)相比,Vero 細胞成功地適應了懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)并產(chǎn)生了更多的 Adv。
實驗前準備:
Vero 和 FRhk-4 細胞使用 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中添加1u/mL的青霉素和 1 µg/mL 鏈霉素。培養(yǎng)條件為 5% CO2含量,37℃。
MRC-5 細胞在含有 10% FBS 和 1 U/mL 青霉素和 1 µg/mL 鏈霉素的改良型 Eagle 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為 5% CO 2中, 37℃培養(yǎng)。
5 型 Adv (Ad5)  - GFP綠色熒光蛋白 。使用含有 2% FBS 的 DMEM 在 Vero 細胞中進行轉染繁殖。
一、培養(yǎng)基的選擇性實驗
OptiPRO SFM 和 VP-SFM 是無血清、超低蛋白培養(yǎng)基,不含蛋白質、肽或其他動物或人類來源的成分。
Gibco 的Opt-MEM 減血清培養(yǎng)基是一種改進的 MEM,可以減少 FBS 的添加量。UltraCULTURE 培養(yǎng)基是一種無血清培養(yǎng)基,設計用于培養(yǎng)補充有重組人胰島素、牛轉鐵蛋白和牛血清蛋白(包括白蛋白)的純化混合物的哺乳動物細胞類型。
SFM4MegaVir屬于一種無蛋白培養(yǎng)基,使用這種培養(yǎng)基的目的在于提高不含動物來源成分的virus  vaccine生 產(chǎn)過程的產(chǎn)量。實驗過程中需要 逐步降低 FBS 的百分比值,來適應無血清培養(yǎng)條件。
我們主要在Optipro、UltraCULTURE、SFM4MegaVir、OptiMEM 和 VP-SFM這五種培養(yǎng)基中嘗試了細胞適應。
1.細胞在 5% CO2 下培養(yǎng)2條件37℃。將細胞以1×10 6 個細胞/培養(yǎng)皿的濃度接種在細胞培養(yǎng)皿中。
2.在 37℃、5% CO 2條件下培養(yǎng) 72 小時后,使用細胞計數(shù)儀和 0.4% 臺盼藍染色測定總細胞數(shù),然后用 1×10 個細胞/盤,逐步減少常規(guī)培養(yǎng)基的百分比。
3.使用放大 100 倍的倒置相差顯微鏡根據(jù)細胞數(shù)量和形狀評估在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞的形態(tài)。
二、Vero 細胞懸浮培養(yǎng)
1.Vero 細胞在 250 mL 錐形瓶中在 5% CO 2條件置于二氧化碳振蕩培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。貼壁細胞置于錐形瓶中,CO2搖床中,5% CO 2條件下,37℃培養(yǎng)5天;
2.使用血細胞計數(shù)器以及 0.4% 臺盼藍染色評估活細胞。
3.接下來,將粘附細胞以1.6×10 5 個細胞/m的密度添加到振蕩懸浮培養(yǎng)物中。連續(xù)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)中的活細胞,并通過臺盼藍染色監(jiān)測其活力180天。
三、細胞轉染
Ad5  Adv包含在巨細胞病毒啟動子控制下的 GFP 基因。用Vero細胞進行Adv繁殖,然后用TCID 50滴定。為了比較粘附培養(yǎng)系統(tǒng)和懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)之間的Adv產(chǎn)量,將兩種類型的 Vero 細胞接種(以 1.3×10 個細胞/mL 的密度)在培養(yǎng)皿或錐形瓶中并孵育 5 小時。然后以0.1的感染復數(shù)感染細胞5天。通過使用熒光酶標儀測量熒光強度來確定產(chǎn)生的 Ad5-GFP 的相對量并使用 GraphPad Prism ver.軟件進行統(tǒng)計分析。
四、統(tǒng)計分析
數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標準誤差。使用 GraphPad Prism ver. 進行統(tǒng)計分析。所有 p 值均使用未配對的雙尾學生 t 檢驗 (α=0.05) 在 p<0.001 的顯著性水平上進行評估。
五、Vero細胞無血清懸浮培養(yǎng)技術驗證
為了研究Vero細胞是否可以在無血清條件下培養(yǎng),對Vero細胞的形態(tài)變化和生長速率進行了VP-SFM、Ultraculture、OptiPRO-SFM、Opti-MEM和SFM4MegaVir測試。在低血清培養(yǎng)條件下,在 OptiPRO、SFM4MegaVir 或 VP-SFM 中培養(yǎng)的 Vero 細胞表現(xiàn)出與在常規(guī)培養(yǎng)基(含 10% FBS 的 DMEM)中培養(yǎng)的 Vero 細胞相似的形態(tài)(圖 1A )). 然而,在 Ultraculture 或 Opti-MEM 中培養(yǎng)的 Vero 細胞表現(xiàn)出異常形態(tài),例如細胞聚集,這在常規(guī)培養(yǎng)條件下是觀察不到的。當血清濃度從 10% 降低到 0% 時,OptiPRO 培養(yǎng)的 Vero 細胞在 0% FBS 的初始培養(yǎng)階段生長速率降低,但與常規(guī)培養(yǎng)條件(DMEM)相比,它們的生長速率增加并更高在 0% FBS 中培養(yǎng) 51 天后,含 10% FBS)(圖 1B)。然而,在 VP-SFM 或 SFM4MegaVir 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 Vero 細胞的生長速率低于在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的 Vero 細胞??偟膩碚f,使用 OptiPRO 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng) Vero 細胞時不會發(fā)生形態(tài)變化和生長速率下降。


 
圖 1
(A) 在無血清條件下生長的 Vero 細胞形態(tài)。藍色和紅色箭頭代表異常的細胞生長。(B) 與在含有 10% FBS 的 DMEM 中培養(yǎng)的細胞(對照;藍線)相比,在無血清條件下培養(yǎng)的細胞的生長速率。DMEM,Dulbecco 改良的 Eagles 培養(yǎng)基;FBS,胎牛血清。




對照組實驗

我們測試了 Vero 細胞的無血清條件是否可以應用于另一種疫苗株生產(chǎn)細胞系 MRC-5 和對照細胞,即 FRhk-4 細胞。與在常規(guī)培養(yǎng)基(含有 10% FBS 的 MEM)中培養(yǎng)的細胞相比,在 SFM4MegaVir Opti-Pro 或 VP-SFM 中培養(yǎng)的所有 MRC-5 細胞均顯示出異常的細胞形態(tài),例如細胞縮短(圖 2A )。在 Opti-MEM、SFM4MegaVir、Opti-Pro、VP-SFM 或 Ultraculture 中培養(yǎng)的 FRhk-4 細胞未顯示任何異常形態(tài)(圖 2C)). MRC-5 細胞在 VP-SFM 或 OptiPRO 無血清培養(yǎng)基中的生長速率低于在常規(guī)培養(yǎng)基(含 10% FBS 的 MEM)中培養(yǎng)的細胞,但在 Opti-MEM 或 Ultraculture 培養(yǎng)基中則不然。然而,由于細胞形態(tài)的變化,在 Opti-MEM 或 Ultraculture 中培養(yǎng)的 MRC-5 細胞在 8% FBS 下無法持續(xù)減少(圖 2B)。在 VP-SFM 或 Opti-MEM 中培養(yǎng)的 FRhk-4 細胞顯示出與在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)期間相似的生長速率(圖 2D)。


總之,在沒有 FBS 的情況下,Vero 細胞的適宜培養(yǎng)條件可能不適用于其他疫苗株生產(chǎn)細胞,例如 MRC-5 細胞。
 
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