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當(dāng)前位置:首頁(yè)技術(shù)文章免疫熒光標(biāo)記法

免疫熒光標(biāo)記法

更新時(shí)間:2023-11-22點(diǎn)擊次數(shù):1396

免疫熒光標(biāo)記法

1、細(xì)胞膜上的免疫熒光檢測(cè)法

間接標(biāo)記法

1)    制備單細(xì)胞懸液;

2)    細(xì)胞計(jì)數(shù),取出  106 個(gè)細(xì)胞于試管中;

3)   用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù),要求活細(xì)胞數(shù) >90  95%;

4)   在試管中加入一抗,(劑量按照說(shuō)明書的要求),孵育 30  60 分鐘;

5)    PBS 洗滌 1  2 次, 1500rpm,離心 3 分鐘,棄上清;

6)   加入二抗,孵育 20  30 分鐘;

7)   PBS 洗一次, 1500rpm,離心 3 分鐘,棄上清;

8)    300μl PBS,上機(jī)檢測(cè)(若不能及時(shí)上機(jī)檢測(cè), 可加 1ml 1%多聚甲醛固 定,可放置 1 )。

直接標(biāo)記法

 ~ 同間接標(biāo)記法

在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體,混勻,孵育 30 分鐘;

 PBS  2 次, 1500rpm,離心 3 鐘,棄上清;

 300μl PBS(PH=7.4),上機(jī)檢測(cè)。

2 細(xì)胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法

間接免疫熒光標(biāo)記法

1)   取已制備好的單細(xì)胞懸液,用 1  3%的多聚甲醛固定 30 分鐘(也可 4 保存過(guò)夜 );

2)     PBS 洗兩次,棄上清;

3)    細(xì)胞膜打孔,加入 0.1%皂素 200μl,室溫 10 分鐘;

4)     PBS 洗滌兩次;

5)   加入第一抗體, 室溫 30  60 分鐘, 4過(guò)夜, 同時(shí)須設(shè)陰性對(duì)照或同 型對(duì)照管;

6)     PBS 洗滌兩次;

7)   加入二抗(熒光標(biāo)記的抗體)室溫 20 分鐘,避光;

8)     PBS 洗滌 1  2 次,棄上清;


9)    重懸細(xì)胞于 500μlPBS 中,上機(jī)檢測(cè)。

直接熒光標(biāo)記法

 ~ 同間接熒光標(biāo)記法;

加入熒光素標(biāo)記好的抗體,避光 30 分鐘(同時(shí)做同型對(duì)照管);

 PBS 洗滌1~2次,棄上清;

 300μl PBS 上機(jī)檢測(cè)。

細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記法( 直標(biāo)法)

1)   取出已制備好的未固定的單細(xì)胞懸液  10 6 個(gè)細(xì)胞于試管中; 2)     PBS 洗滌兩次;

3)   加入用熒光素標(biāo)記的抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞膜上的抗原, 同時(shí)加上陰性對(duì)照管, 室溫孵育 20 分鐘;

4)   在試管中加入 1%~3%多聚甲醛 1ml,固定 30 分鐘;

5)   PBS 洗滌兩次 1500rpm 3 分鐘,棄上清;

6)   打孔,加入 0.1%皂素 200μl 室溫 10 分鐘;

7)    PBS 洗滌兩次,棄上清;

8)   加入用熒光素標(biāo)記的抗體,標(biāo)記膜內(nèi)的抗原(標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素

的顏色與膜上標(biāo)記的熒光素的顏色務(wù)必不相同)室溫 20 分鐘孵育;

9)     PBS 洗一遍棄上清;

10)  300μlPBS 重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)

五、流式細(xì)胞術(shù)中的幾點(diǎn)注意事項(xiàng):

1 、對(duì)照組的設(shè)置:

在流式細(xì)胞術(shù)中所測(cè)得的量都是相對(duì)值,不是絕對(duì)值。如需知道絕對(duì)值

時(shí)必須設(shè)置對(duì)照組樣品。對(duì)照組樣品包括有陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

 1 )、陰性對(duì)照的設(shè)置

2 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,如做間接標(biāo)記法,可設(shè)置與一抗無(wú)關(guān)的實(shí)驗(yàn),即在 實(shí)驗(yàn)中不加一抗而只加上帶有熒光標(biāo)記的第二抗體作為陰性對(duì)照

管,作為陰性對(duì)照。

2 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,假設(shè)做直接標(biāo)記法,可設(shè)置理論上的陰性細(xì)胞作為  陰性對(duì)照管, 實(shí)驗(yàn)過(guò)程及步驟與實(shí)驗(yàn)組務(wù)必相同。(做間接標(biāo)記法時(shí) ,

同樣也可同時(shí)設(shè)置 陰性細(xì)胞" 的陰性對(duì)照管作為陰性對(duì)照。

2 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,假設(shè)做直接標(biāo)記法,可將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,取一管,加

上與實(shí)驗(yàn)抗體所標(biāo)記的熒光顏色相同的同型對(duì)照來(lái)作為陰性對(duì)照。 

2)、陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置:

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如涉及到表達(dá)缺失或減少的實(shí)驗(yàn),應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組,其設(shè)置方法與陰性對(duì)照設(shè)置相同。

2、幾點(diǎn)建議:

1)   在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 在保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上, 應(yīng)盡量減少實(shí)驗(yàn)工 序和過(guò)程。由于間接標(biāo)記法的工序多,實(shí)驗(yàn)過(guò)程長(zhǎng), 如再加之操作的不熟練 , 細(xì)胞更容易丟失和受損, 而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。因此,在條件允許的范圍 內(nèi), 建議盡量做直接標(biāo)記法而不去做間接標(biāo)記法, 以保證實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和準(zhǔn) 確性。

2)    建議送檢細(xì)胞一定要足夠量, 一般要求  106 個(gè)細(xì)胞。不要過(guò)少。因?yàn)椋?/span> 細(xì)胞太少檢測(cè)時(shí)樣本流量相對(duì)會(huì)增大從而影響變異系數(shù), 結(jié)果也不可信。 細(xì) 胞量也不宜過(guò)多, 因細(xì)胞量太多加入的抗體或染料相對(duì)不足, 結(jié)果也由此受

影響。

3) 同一種細(xì)胞需同時(shí)做雙標(biāo)記時(shí), 須做雙標(biāo)記的同型對(duì)照, 且兩種抗體所標(biāo)記 的熒光顏色務(wù)必不同。


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